Cours d'électrophorèse

Leçon 1 • Variables clés affectant la séparation

Identifie la tension, la température, le pH et la composition de l'échantillon comme paramètres critiques. Les apprenants apprennent à prédire comment la modification de chaque variable modifie les schémas de migration.

Leçon 2 • Développement historique et applications

Retrace l'électrophorèse des premières études sur les protéines sériques à la génomique moderne. Contextualise l'évolution de la technique et motive les chapitres techniques suivants.

Leçon 3 • Principes de la migration des molécules chargées

Couvre la charge ionique, les interactions avec le champ électrique et les concepts de charge nette. Relie l'électrochimie fondamentale à la raison pour laquelle les molécules se déplacent dans un gel ou une matrice en solution.

Leçon 1 • Systèmes de gel spécialisés et modifiés

Présente les gels gradients, les gels dénaturants et l'agarose à bas point de fusion. Élargit la boîte à outils de l'apprenant pour les séparations difficiles rencontrées dans les chapitres suivants.

Leçon 2 • Systèmes tampons et leurs fonctions

Compare les tampons TAE, TBE, MOPS, Tris-glycine et MES en fonction de leur zone tampon et de leur force ionique. Les apprenants associent le choix du tampon au type d'analyte et aux applications en aval.

Leçon 3 • Chimie du gel de polyacrylamide

Explique la polymérisation de l'acrylamide et du bis-acrylamide, la densité de réticulation et la notation %T/%C. Prépare les apprenants à formuler des gels pour la séparation des protéines et des petits acides nucléiques.

Leçon 1 • Marqueurs de poids moléculaire et échelles

Explique la composition de l'échelle, la taille des fragments et les quantités de dépôt appropriées. Une estimation précise de la taille dépend de la sélection correcte du marqueur et du placement du puits.

Leçon 2 • Résolution des problèmes courants des gels

Identifie les causes de traînées, de pistes déformées, de bandes faibles et de fluorescence de fond. Les compétences de résolution systématique des problèmes s'appliquent à toutes les techniques en gel des chapitres suivants.

Leçon 3 • Coloration, visualisation et documentation

Compare les méthodes de coloration au bromure d'éthidium, au SYBR Safe et au GelRed ainsi que l'imagerie UV/lumière bleue. Les apprenants sélectionnent des protocoles de coloration sûrs et sensibles et documentent correctement les résultats.

Leçon 4 • Préparation des échantillons pour les acides nucléiques

Couvre la quantification de l'ADN et de l'ARN, la composition du tampon de dépôt et la dénaturation pour l'ARN. Une préparation appropriée prévient les traînées et assure une migration reproductible.

Leçon 1 • Formulation du gel pour SDS-PAGE

Couvre la composition du gel de concentration et du gel de séparation, les pourcentages d'acrylamide et les options de gradient. Les apprenants formulent des gels adaptés à la gamme de poids moléculaire de leurs protéines cibles.

Leçon 2 • Estimation du poids moléculaire et analyse des bandes

Utilise des échelles de protéines et une régression linéaire sur des graphiques semi-logarithmiques pour estimer les poids moléculaires. Les apprenants interprètent les schémas de bandes pour évaluer la pureté, la dégradation et les niveaux d'expression.

Leçon 3 • Réalisation du SDS-PAGE et coloration des protéines

Guide les apprenants à travers l'assemblage, les conditions d'électrophorèse et la coloration au bleu de Coomassie ou à l'argent. Une exécution correcte produit des bandes nettes et bien résolues adaptées à l'analyse en aval.

Leçon 4 • Préparation des échantillons de protéines

Détaille les méthodes de lyse, les dosages de quantification des protéines et la préparation du tampon d'échantillon. Une préparation cohérente de l'échantillon est un prérequis pour des résultats SDS-PAGE reproductibles.

Leçon 1 • Systèmes de détection et génération de signal

Compare les méthodes de détection par chimiluminescence ECL, fluorescence et colorimétrique. Les apprenants sélectionnent les systèmes de détection en fonction des exigences de sensibilité et de l'instrumentation disponible.

Leçon 2 • Blocage et incubation des anticorps

Couvre les agents de blocage, l'optimisation de la dilution des anticorps primaires et la sélection des anticorps secondaires. Des conditions de blocage et d'anticorps appropriées minimisent le bruit de fond et maximisent la spécificité du signal.

Leçon 3 • Transfert des protéines sur membranes

Compare les systèmes de transfert humide, semi-sec et sec ainsi que les membranes PVDF vs nitrocellulose. L'efficacité du transfert détermine directement la sensibilité de détection dans les étapes suivantes.

Leçon 4 • Analyse quantitative du western blot

Présente les contrôles de charge, les stratégies de normalisation et les logiciels de densitométrie. Les apprenants produisent des données quantitatives statistiquement valides à partir d'images de western blot.

Leçon 1 • Réhydratation des bandelettes IPG et protocole IEF

Détaille les méthodes de dépôt d'échantillon, les conditions de réhydratation et les programmes de montée en tension IEF. Une exécution correcte du protocole prévient les traînées horizontales et assure une focalisation nette.

Leçon 2 • Principes du PAGE natif

Explique la séparation par charge, taille et forme dans des conditions non dénaturantes. Les apprenants comprennent quand le PAGE natif est préféré au SDS-PAGE pour les études fonctionnelles.

Leçon 3 • Fondamentaux de la focalisation isoélectrique

Explique la formation du gradient de pH, la focalisation des protéines au pI, et les systèmes d'ampholytes porteurs vs bandelettes IPG. L'IEF résout les protéines différant d'aussi peu que 0,01 unité de pH.

Leçon 4 • Électrophorèse bidimensionnelle sur gel

Combine l'IEF et le SDS-PAGE pour résoudre des milliers de protéines par pI et poids moléculaire. Les apprenants exécutent des flux de travail 2-DE et interprètent des motifs de spots complexes.

Leçon 1 • Électrophorèse capillaire en gel pour les acides nucléiques

Applique des capillaires remplis de polymère pour le dimensionnement des fragments d'ADN et l'évaluation de la qualité de l'ARN. La CGE remplace les gels en plaque par une analyse automatisée, quantitative et à haut débit.

Leçon 2 • Électrophorèse capillaire de zone

Couvre les principes de séparation CZE, la sélection du tampon et les modes d'injection pour les petites molécules et les protéines. Les apprenants développent et valident des méthodes CZE pour des classes d'analytes définies.

Leçon 3 • Instrumentation pour l'électrophorèse capillaire

Décrit les dimensions des capillaires, les alimentations haute tension, les détecteurs et les composants de l'échantillonneur automatique. La connaissance de l'instrument est un prérequis au développement de méthodes dans les sections suivantes.

Leçon 4 • Focalisation isoélectrique capillaire

Adapte les principes de l'IEF au format capillaire pour la détermination du pI des protéines et le profilage des isoformes. Les apprenants comparent la cIEF à l'IEF sur gel en termes de résolution et de débit.

Leçon 1 • Développement et validation de méthode

Applique les principes des plans d'expériences pour optimiser le pourcentage de gel, le tampon et les conditions de migration. Les paramètres de validation incluent la spécificité, la linéarité, la plage et la reproductibilité.

Leçon 2 • Densitométrie quantitative et analyse d'image

Couvre les réglages d'acquisition d'image, la soustraction du bruit de fond et l'analyse du profil des pistes pour une quantification précise. Les apprenants utilisent des outils logiciels pour extraire des données numériques fiables à partir d'images de gel.

Leçon 3 • Électrophorèse en champ pulsé

Explique les principes du champ électrique alternatif permettant la séparation de l'ADN de taille mégabasique. Les apprenants appliquent la PFGE au typage microbien et à l'analyse de grands génomes.

Leçon 4 • Intégration avec les méthodes analytiques en aval

Relie les sorties de l'électrophorèse à la spectrométrie de masse, au séquençage et aux dosages fonctionnels. Les apprenants conçoivent des flux de travail en plusieurs étapes où l'électrophorèse sert d'étape préparative ou analytique.