Curso de Proteômica

Aula 1 • Considerações Éticas e Regulamentares

Aborda o consentimento informado, a privacidade dos dados e as normas de manuseamento de amostras biológicas na investigação em proteómica. Garante que os formandos compreendem as obrigações de conformidade antes de realizar experiências.

Aula 2 • Funções Biológicas das Proteínas

Analisa as funções das proteínas: estruturais, enzimáticas, de sinalização e reguladoras. Relaciona a função proteica com a motivação para a investigação proteómica em grande escala.

Aula 3 • O Proteoma: Âmbito e Complexidade

Define o proteoma e contrasta-o com o genoma e o transcriptoma. Estabelece por que razão a diversidade proteica excede o número de genes, fundamentando toda a lógica analítica subsequente.

Aula 4 • História e Marcos da Proteómica

Traça a evolução da proteómica desde a eletroforese em gel bidimensional até à espetrometria de massa moderna. Fornece o contexto histórico que explica as escolhas metodológicas atuais.

Aula 1 • Propriedades e Classificação dos Aminoácidos

Aborda os vinte aminoácidos padrão, a química das suas cadeias laterais e as suas propriedades físico-químicas. Estas propriedades determinam diretamente o comportamento das proteínas durante a cromatografia e a eletroforese.

Aula 2 • Solubilidade e Estabilidade das Proteínas

Examina os fatores que afetam a solubilidade, a agregação e a degradação das proteínas. Orienta os formandos na seleção de condições de tampão e estratégias de armazenamento para preservar a integridade da amostra.

Aula 3 • Modificações Pós-Traducionais em Profundidade

Detalha as principais MPT, incluindo fosforilação, glicosilação, ubiquitinação e acetilação. Explica como as MPT alteram a massa e a função das proteínas, impactando diretamente a deteção por espetrometria de massa.

Aula 4 • Princípios de Quantificação de Proteínas

Apresenta ensaios colorimétricos e de UV para medir a concentração de proteínas. A quantificação precisa é fundamental para experiências reprodutíveis de proteómica a jusante.

Aula 1 • Estratégias de Digestão Enzimática

Aborda a tripsina e proteases alternativas, condições de digestão e gestão de clivagens perdidas. A qualidade da geração de péptidos determina diretamente as taxas de identificação por espetrometria de massa.

Aula 2 • Limpeza e Dessalinização de Amostras

Apresenta a extração em fase sólida, métodos assistidos por filtro e colunas de dessalinização para remover contaminantes. Amostras limpas são essenciais para um desempenho ótimo da cromatografia e da espetrometria de massa.

Aula 3 • Tipos de Amostras Biológicas e Colheita

Analisa fontes de amostras, incluindo células, tecidos, biofluidos e organelos. A colheita e o manuseamento adequados previnem a degradação e o enviesamento antes de qualquer etapa analítica.

Aula 4 • Enriquecimento de Proteínas de Baixa Abundância

Descreve a depleção de proteínas de alta abundância e o enriquecimento direcionado de péptidos com MPT. As estratégias de enriquecimento expandem a cobertura do proteoma em matrizes biológicas complexas.

Aula 5 • Desnaturação e Redução de Proteínas

Explica a desnaturação com caotrópicos, a redução de pontes dissulfureto e a alquilação de cisteínas. Estas etapas garantem uma digestão completa e uma identificação precisa dos péptidos.

Aula 1 • Cromatografia de Troca Iónica e Hidrófila

Apresenta a troca catiónica forte e a HILIC como modos de fracionamento ortogonais. O fracionamento multidimensional aumenta a profundidade do proteoma ao reduzir a coeluição de péptidos.

Aula 2 • Cromatografia Líquida em Fase Reversa

Explica as fases estacionárias de RP-LC, os gradientes de fase móvel e os mecanismos de retenção de péptidos. A RP-LC é o modo de separação dominante acoplado à espetrometria de massa em proteómica.

Aula 3 • Eletroforese em Gel em Proteómica

Aborda os princípios e aplicações de SDS-PAGE, PAGE nativa e eletroforese em gel bidimensional. As separações baseadas em gel continuam a ser fundamentais para a visualização de proteínas e a excisão direcionada.

Aula 4 • Métodos de Separação Baseados em Afinidade

Descreve a imunoprecipitação, a coimunoprecipitação e os ensaios de pull-down para isolamento direcionado de proteínas. Os métodos de afinidade permitem o estudo de complexos proteicos e redes de interação.

Aula 1 • Analisadores de Massa e Seus Princípios

Compara analisadores de quadrupolo, armadilha iónica, Orbitrap e tempo de voo em termos de resolução, exatidão de massa e velocidade. A seleção do analisador determina a profundidade e a exatidão da cobertura do proteoma.

Aula 2 • Modos de Aquisição de Dados

Distingue estratégias de aquisição dependente de dados de aquisição independente de dados. A seleção do modo de aquisição equilibra a cobertura do proteoma, a reprodutibilidade e a exatidão quantitativa.

Aula 3 • Métodos de Ionização para Proteómica

Explica a ionização por eletropulverização e a MALDI como as duas técnicas de ionização dominantes. A escolha do método de ionização determina o formato da amostra, o débito e os tipos de analitos detetados.

Aula 4 • Calibração do Instrumento e Controlo de Qualidade

Descreve a calibração de massa, a lock mass e os protocolos de teste de aptidão do sistema. O CQ de rotina garante a qualidade dos dados e a comparabilidade entre experiências e plataformas instrumentais.

Aula 1 • Quantificação por Marcação Isotópica

Aborda estratégias de marcação SILAC, iTRAQ e TMT para quantificação relativa e absoluta. A marcação isotópica reduz a variabilidade técnica e permite a comparação multiplexada de amostras.

Aula 2 • Análise Estatística de Dados de Proteómica

Aplica testes t, ANOVA e correção para testes múltiplos para identificar proteínas expressas diferencialmente. A estatística rigorosa distingue alterações biologicamente significativas do ruído técnico.

Aula 3 • Pontuação de Identificação de Péptidos e Proteínas

Aborda funções de pontuação, validação de correspondências espetro-péptido e regras de inferência proteica. Compreender a pontuação evita a sobrestimação de falsos positivos em grandes conjuntos de dados proteómicos.

Aula 4 • Pipelines e Software Bioinformáticos

Analisa MaxQuant, Proteome Discoverer, Perseus e alternativas de código aberto para análise de ponta a ponta. A familiaridade com várias plataformas permite um processamento de dados flexível e reprodutível.

Aula 5 • Métodos de Quantificação Sem Marcação

Apresenta a contagem espectral e a quantificação sem marcação baseada em cromatogramas de iões extraídos. A LFQ permite a quantificação ampla do proteoma sem reagentes de marcação química.

Aula 1 • Fosfoproteómica e Análise de Sinalização

Aborda o enriquecimento de fosfopéptidos, a pontuação de localização de fosfossítios e a análise de redes cinase-substrato. A fosfoproteómica mapeia vias de sinalização ativas a um nível sistémico.

Aula 2 • Proteómica de Interações Proteína-Proteína

Apresenta AP-MS, BioID e espetrometria de massa com reticulação para mapear redes de interação. A proteómica de interações revela a composição de complexos proteicos e a organização espacial.

Aula 3 • Quantificação Absoluta de Proteínas

Aborda péptidos AQUA, padrões QconCAT e MS direcionada para quantificação molar absoluta. A quantificação absoluta permite a modelação estequiométrica de sistemas biológicos.

Aula 4 • Proteómica Estrutural em Larga Escala

Explica a proteólise limitada, a análise térmica do proteoma e a troca hidrogénio-deutério para perceções estruturais. Estes métodos ligam a conformação proteica à função e à ligação de fármacos.

Aula 1 • Proteómica Direcionada para Verificação

Aplica ensaios SRM e PRM para verificar candidatos a biomarcadores com elevada sensibilidade e especificidade. Os ensaios direcionados ligam a proteómica de descoberta ao desenvolvimento de imunoensaios clínicos.

Aula 2 • Normas de Partilha de Dados e Reprodutibilidade

Aborda repositórios de dados proteómicos, normas mínimas de comunicação e requisitos de metadados experimentais. A adesão às normas da comunidade permite a reutilização de dados e comparações entre estudos.

Aula 3 • Proteómica de Amostras Clínicas

Aborda a proteómica de plasma, soro, urina e líquido cefalorraquidiano com desafios específicos da matriz. A complexidade da matriz clínica exige estratégias especializadas de depleção e normalização.

Aula 4 • Proteómica no Desenvolvimento de Fármacos

Explora a identificação de alvos, estudos de mecanismo de ação e proteómica de toxicidade na investigação farmacêutica. A proteómica acelera o desenvolvimento de fármacos ao revelar efeitos off-target e mecanismos de resistência.