Curso de Edição Genética com CRISPR

Aula 1 • Replicação e Reparo do DNA

Detalha os mecanismos de fidelidade da replicação e as vias endógenas de reparo do DNA. Fornece o contexto mecanicista para a resolução de quebras induzidas por CRISPR.

Aula 2 • Expressão e Regulação Gênica

Explica a transcrição, a tradução e os elementos reguladores que controlam a produção gênica. Relaciona o controle da expressão aos resultados da edição por CRISPR.

Aula 3 • Arquitetura e Variação do Genoma

Examina elementos repetitivos, famílias gênicas e polimorfismos de nucleotídeo único. Contextualiza a seleção de sítios-alvo em genomas complexos.

Aula 1 • Princípios de Desenho do RNA Guia

Abrange a estrutura do sgRNA, as regras de seleção do espaçador e as considerações sobre a estrutura secundária. Permite diretamente o desenho eficaz de guias nos capítulos seguintes.

Aula 2 • Proteínas Cas Alternativas

Compara Cas12a, Cas13 e outros ortólogos em termos de PAM, padrão de corte e tamanho da carga. Expande o kit de ferramentas de edição além da Cas9.

Aula 3 • Estrutura e Função da Cas9

Detalha os domínios proteicos da Cas9, as mudanças conformacionais e a atividade de nuclease. Relaciona as características estruturais à precisão da edição e ao risco de efeitos fora do alvo.

Aula 4 • Sequências PAM e Acessibilidade do Alvo

Analisa os requisitos de PAM em variantes Cas e os efeitos da cromatina no acesso ao alvo. Guia a seleção de sítios-alvo para diversos loci genômicos.

Aula 1 • Identificação do Sítio-Alvo

Ensina a varredura sistemática de loci genômicos em busca de sítios PAM e sequências únicas. Constitui o primeiro passo prático em qualquer projeto de edição.

Aula 2 • Predição e Pontuação de Efeitos Fora do Alvo

Aplica ferramentas computacionais para classificar guias por especificidade e prever sítios fora do alvo. Reduz a edição não intencional antes do início dos experimentos.

Aula 3 • Modificações Químicas do RNA Guia

Descreve as modificações 2'-O-metil, fosforotioato e outras que aumentam a estabilidade. Melhora o desempenho do guia em contextos celulares e in vivo.

Aula 4 • Verificação Experimental do Guia

Descreve ensaios de clivagem em sistema livre de células, sistemas repórteres e verificação baseada em sequenciamento. Confirma a atividade do guia antes de se comprometer com experimentos completos.

Aula 1 • Carreadores Lipídicos e Poliméricos Não Virais

Abrange nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas e exossomos para carga CRISPR. Destaca as vantagens para a tradução clínica e a imunogenicidade reduzida.

Aula 2 • Técnicas de Entrega Física

Detalha a eletroporação, a microinjeção e a biolística para a introdução direta de componentes. Útil para células primárias e organismos resistentes à transfecção química.

Aula 3 • Entrega de Complexos Ribonucleoproteicos

Explica a entrega de RNPs pré-montadas Cas9-sgRNA para edição transitória e de baixa imunogenicidade. Reduz a atividade fora do alvo em comparação com abordagens baseadas em plasmídeos.

Aula 4 • Sistemas de Entrega por Vetores Virais

Examina AAV, lentivírus e adenovírus como veículos de entrega CRISPR com tropismo e capacidade distintos. Estabelece as compensações entre eficiência e segurança.

Aula 1 • Controle da Especificidade da Edição

Aplica nickases pareadas, guias truncados e proteínas anti-CRISPR para reduzir edições fora do alvo. Equilibra a eficiência no alvo com a segurança genômica geral.

Aula 2 • Estratégias de Inserção de Fragmentos Grandes

Aborda os desafios da inserção de sequências da escala de quilobases usando doadores virais e não virais. Expande a capacidade de edição para a substituição completa de genes.

Aula 3 • Resultados da Junção de Extremidades Não Homólogas

Caracteriza o espectro de indels, a probabilidade de mudança de quadro de leitura e a eficiência de disrupção gênica via NHEJ. Fornece a base para o desenho de experimentos de nocauteamento.

Aula 4 • Aumento da Eficiência de HDR

Revisa potenciadores de HDR de pequenas moléculas, sincronização do ciclo celular e variantes da Cas9. Aumenta as taxas de edição precisa em tipos celulares difíceis.

Aula 1 • Sequenciamento Profundo de Amplicons

Aplica o sequenciamento de nova geração para quantificar tipos de indels e taxas de HDR em resolução de base. Possibilita o perfil preciso dos resultados da edição.

Aula 2 • Ensaios Funcionais para Confirmação da Edição

Valida as edições por meio de expressão proteica, atividade enzimática e leituras fenotípicas. Relaciona as edições moleculares à função biológica.

Aula 3 • Rastreamento Genômico de Efeitos Fora do Alvo

Abrange GUIDE-seq, CIRCLE-seq e DISCOVER-seq para mapeamento imparcial de sítios fora do alvo. Valida a segurança da edição em todo o genoma.

Aula 4 • Testes de Pareamento Incorreto Surveyor e T7E1

Usa nucleases sensíveis a pareamentos incorretos para detectar indels em sítios-alvo rapidamente. Oferece um teste rápido e de baixo custo antes do sequenciamento profundo.

Aula 1 • Ativação Gênica por CRISPRa

Aplica fusões dCas9-ativador para regular positivamente a expressão gênica endógena. Complementa estudos de nocauteamento com abordagens de ganho de função.

Aula 2 • Silenciamento Gênico por CRISPRi

Usa dCas9 fundida a repressores para silenciar genes-alvo sem alterar a sequência. Viabiliza estudos de perda de função reversíveis.

Aula 3 • Princípios da Edição Primária

Abrange o desenho do pegRNA, a fusão da transcriptase reversa e a inserção baseada em nick para todas as 12 trocas de bases. Alcança precisão versátil sem DNA doador.

Aula 4 • Tecnologia de Edição de Base

Explica os editores de base de citosina e adenina que instalam mutações pontuais sem DSBs. Viabiliza alterações precisas de nucleotídeo único com risco reduzido de indels.

Aula 1 • Edição para Terapia Celular Ex Vivo

Abrange os fluxos de trabalho de isolamento de células do paciente, edição, controle de qualidade e reinfusão para doenças genéticas. Integra habilidades de entrega, reparo e análise de segurança.

Aula 2 • Edição do Genoma Agrícola e de Plantas

Aplica CRISPR à melhoria de culturas, resistência a doenças e aumento de produtividade. Destaca as distinções regulatórias entre edições transgênicas e não transgênicas.

Aula 3 • Desenho de Projeto e Avaliação de Risco

Guia os alunos na seleção do alvo, escolha da entrega, testes de segurança e planejamento da via regulatória. Sintetiza todas as habilidades do curso em um projeto coerente.

Aula 4 • Diagnósticos Baseados em CRISPR

Explica as plataformas SHERLOCK e DETECTR para detecção de ácidos nucleicos usando Cas13 e Cas12. Estende a utilidade do CRISPR para diagnósticos no ponto de cuidado / teste rápido à beira do leito.