Curso de Eletroforese

Aula 1 • Principais Variáveis que Afetam a Separação

Identifica tensão, temperatura, pH e composição da amostra como parâmetros críticos. Os alunos aprendem a prever como a alteração de cada variável altera os padrões de migração.

Aula 2 • Desenvolvimento Histórico e Aplicações

Traça a eletroforese desde os primeiros estudos de proteínas séricas até a genômica moderna. Contextualiza a evolução da técnica e motiva os capítulos técnicos subsequentes.

Aula 3 • Princípios da Migração de Moléculas Carregadas

Aborda carga iônica, interações com campo elétrico e conceitos de carga líquida. Conecta a eletroquímica fundamental à razão pela qual as moléculas se movem em uma matriz de gel ou solução.

Aula 1 • Sistemas de Gel Especializados e Modificados

Apresenta géis gradientes, géis desnaturantes e agarose de baixo ponto de fusão. Expande o conjunto de ferramentas dos alunos para separações desafiadoras encontradas em capítulos posteriores.

Aula 2 • Sistemas Tampão e Suas Funções

Compara os tampões TAE, TBE, MOPS, Tris-glicina e MES quanto à faixa de tamponamento e força iônica. Os alunos associam a escolha do tampão ao tipo de analito e às aplicações a jusante.

Aula 3 • Química do Gel de Poliacrilamida

Explica a polimerização da acrilamida e da bis-acrilamida, a densidade de reticulação e a notação %T/%C. Prepara os alunos para formular géis para separação de proteínas e pequenos ácidos nucleicos.

Aula 1 • Marcadores de Peso Molecular e Escadas

Explica a composição da escada, o dimensionamento dos fragmentos e as quantidades adequadas de aplicação. A estimativa precisa do tamanho depende da seleção correta do marcador e do posicionamento do poço.

Aula 2 • Solução de Problemas em Defeitos Comuns de Gel

Identifica causas de arrasto, distorção de poços, bandas fracas e fluorescência de fundo. Habilidades sistemáticas de solução de problemas se transferem para todas as técnicas em gel em capítulos posteriores.

Aula 3 • Coloração, Visualização e Documentação

Compara métodos de coloração com brometo de etídio, SYBR Safe e GelRed e imageamento por UV/luz azul. Os alunos selecionam protocolos de coloração seguros e sensíveis e documentam os resultados adequadamente.

Aula 4 • Preparação de Amostras Biológicas para Ácidos Nucleicos

Aborda a quantificação de DNA e RNA, a composição do tampão de aplicação e a desnaturação para RNA. A preparação adequada da amostra biológica evita arrasto e garante migração reprodutível.

Aula 1 • Formulação do Gel para SDS-PAGE

Aborda a composição do gel de empilhamento e de separação, as porcentagens de acrilamida e as opções de gradiente. Os alunos formulam géis adequados à faixa de peso molecular de suas proteínas alvo.

Aula 2 • Estimativa de Peso Molecular e Análise de Bandas

Utiliza escadas de proteínas e regressão linear em gráficos semi-log para estimar pesos moleculares. Os alunos interpretam padrões de bandas para avaliar pureza, degradação e níveis de expressão.

Aula 3 • Execução da SDS-PAGE e Coloração de Proteínas

Orienta os alunos na montagem, nas condições de eletroforese e na coloração com Coomassie ou prata. A execução adequada produz bandas nítidas e bem resolvidas, adequadas para análises a jusante.

Aula 4 • Preparação de Amostras de Proteínas

Detalha métodos de lise, ensaios de quantificação de proteínas e preparação do tampão de amostra. A preparação consistente da amostra é pré-requisito para resultados reprodutíveis de SDS-PAGE.

Aula 1 • Sistemas de Detecção e Geração de Sinal

Compara métodos de detecção por quimioluminescência ECL, fluorescente e colorimétrica. Os alunos selecionam sistemas de detecção com base nos requisitos de sensibilidade e na instrumentação disponível.

Aula 2 • Bloqueio e Incubação com Anticorpos

Aborda agentes de bloqueio, otimização da diluição do anticorpo primário e seleção do anticorpo secundário. Condições adequadas de bloqueio e anticorpo minimizam o fundo e maximizam a especificidade do sinal.

Aula 3 • Transferência de Proteínas para Membranas

Compara sistemas de transferência úmida, semi-seca e seca e membranas de PVDF vs. nitrocelulose. A eficiência da transferência determina diretamente a sensibilidade da detecção nas etapas subsequentes.

Aula 4 • Análise Quantitativa de Western Blot

Apresenta controles de carregamento, estratégias de normalização e software de densitometria. Os alunos produzem dados quantitativos estatisticamente válidos a partir de imagens de western blot.

Aula 1 • Reidratação de Tiras IPG e Protocolo de IEF

Detalha métodos de aplicação de amostra, condições de reidratação e programas de rampa de voltagem da IEF. A execução correta do protocolo previne estrias horizontais e garante focalização nítida.

Aula 2 • Princípios do PAGE Nativo

Explica a separação por carga, tamanho e forma sob condições não desnaturantes. Os alunos entendem quando o PAGE nativo é preferido ao SDS-PAGE para estudos funcionais.

Aula 3 • Fundamentos da Focalização Isoelétrica

Explica a formação do gradiente de pH, a focalização da proteína no pI e os sistemas de anfólitos carreadores vs. tiras IPG. A IEF resolve proteínas que diferem em apenas 0,01 unidades de pH.

Aula 4 • Eletroforese Bidimensional em Gel

Combina IEF e SDS-PAGE para resolver milhares de proteínas por pI e peso molecular. Os alunos executam fluxos de trabalho de 2-DE e interpretam padrões complexos de spots.

Aula 1 • Eletroforese Capilar em Gel para Ácidos Nucleicos

Aplica capilares preenchidos com polímero para dimensionamento de fragmentos de DNA e avaliação de qualidade de RNA. A CGE substitui géis em placa por análise automatizada, quantitativa e de alto rendimento.

Aula 2 • Eletroforese Capilar de Zona

Aborda os princípios de separação da CZE, seleção de tampão e modos de injeção para moléculas pequenas e proteínas. Os alunos desenvolvem e validam métodos de CZE para classes definidas de analitos.

Aula 3 • Instrumentação para Eletroforese Capilar

Descreve dimensões do capilar, fontes de alta tensão, detectores e componentes do amostrador automático. A familiaridade com o instrumento é pré-requisito para o desenvolvimento de métodos em seções subsequentes.

Aula 4 • Focalização Isoelétrica Capilar

Adapta os princípios da IEF para o formato capilar para determinação do pI de proteínas e perfil de isoformas. Os alunos comparam a cIEF à IEF em gel quanto à resolução e rendimento.

Aula 1 • Desenvolvimento e Validação de Métodos

Aplica princípios de planejamento de experimentos para otimizar porcentagem do gel, tampão e condições de corrida. Os parâmetros de validação incluem especificidade, linearidade, faixa e reprodutibilidade.

Aula 2 • Densitometria Quantitativa e Análise de Imagem

Aborda configurações de aquisição de imagem, subtração de fundo e análise de perfil de poços para quantificação precisa. Os alunos usam ferramentas de software para extrair dados numéricos confiáveis de imagens de gel.

Aula 3 • Eletroforese em Gel de Campo Pulsado

Explica os princípios do campo elétrico alternado que permitem a separação de DNA de megabases. Os alunos aplicam a PFGE à tipagem microbiana e à análise de grandes genomas.

Aula 4 • Integração com Métodos Analíticos a Jusante

Conecta os resultados da eletroforese à espectrometria de massas, sequenciamento e ensaios funcionais. Os alunos projetam fluxos de trabalho de múltiplas etapas onde a eletroforese serve como etapa preparativa ou analítica.