Curs de Electroforeză

Lecția 1 • Variabilele cheie care afectează separarea

Identifică tensiunea, temperatura, pH-ul și compoziția probei ca parametri critici. Studenții învață să prezică modul în care modificarea fiecărei variabile schimbă modelele de migrare.

Lecția 2 • Dezvoltarea istorică și aplicațiile

Urmează evoluția electroforezei de la studiile timpurii ale proteinelor serice până la genomica modernă. Contextualizează evoluția tehnicii și motivează capitolele tehnice ulterioare.

Lecția 3 • Principiile migrării moleculelor încărcate

Acoperă sarcina ionică, interacțiunile cu câmpul electric și conceptele de sarcină netă. Conectează electrochimia fundamentală la motivul pentru care moleculele se deplasează într-o matrice de gel sau soluție.

Lecția 1 • Sisteme de gel speciale și modificate

Introducere în gelurile cu gradient, gelurile denaturante și agaroza cu punct de topire scăzut. Extinde setul de instrumente al studentului pentru separări dificile întâlnite în capitolele ulterioare.

Lecția 2 • Sistemele tampon și funcțiile lor

Compară tampoanele TAE, TBE, MOPS, Tris-glicină și MES în funcție de intervalul de tamponare și forța ionică. Studenții asociază alegerea tamponului cu tipul de analit și aplicațiile ulterioare.

Lecția 3 • Chimia gelurilor de poliacrilamidă

Explică polimerizarea acrilamidei și bis-acrilamidei, densitatea de reticulare și notația %T/%C. Pregătește studenții să formuleze geluri pentru separarea proteinelor și acizilor nucleici mici.

Lecția 1 • Marcatori de greutate moleculară și scări de masă

Explică compoziția scării de masă, dimensionarea fragmentelor și volumele corecte de încărcare. Estimarea corectă a dimensiunii depinde de selectarea corectă a markerului și de plasarea pe bandă.

Lecția 2 • Depanarea defectelor comune ale gelurilor

Identifică cauzele petelor neclare, benzilor deformate, benzilor slabe și fluorescenței de fond. Abilitățile sistematice de depanare se transferă la toate tehnicile pe gel din capitolele ulterioare.

Lecția 3 • Colorare, vizualizare și documentare

Compară metodele de colorare cu bromură de etidiu, SYBR Safe și GelRed și imagistica UV/lumină albastră. Studenții selectează protocoale de colorare sigure și sensibile și documentează corect rezultatele.

Lecția 4 • Prepararea probelor pentru acizi nucleici

Acoperă cuantificarea ADN-ului și ARN-ului, compoziția tamponului de încărcare și denaturarea pentru ARN. Prepararea corectă previne petele neclare și asigură o migrare reproductibilă.

Lecția 1 • Formularea gelului pentru SDS-PAGE

Acoperă compoziția gelului de concentrare și separare, procentele de acrilamidă și opțiunile cu gradient. Studenții formulează geluri adaptate intervalului de greutate moleculară a proteinelor țintă.

Lecția 2 • Estimarea greutății moleculare și analiza benzilor

Utilizează scări de masă proteice și regresie liniară pe grafice semi-log pentru a estima greutățile moleculare. Studenții interpretează modelele de benzi pentru a evalua puritatea, degradarea și nivelurile de expresie.

Lecția 3 • Desfășurarea SDS-PAGE și colorarea proteinelor

Ghidează studenții prin asamblare, condițiile de electroforeză și colorarea Coomassie sau cu argint. Executarea corectă produce benzi clare și bine rezolvate, potrivite pentru analize ulterioare.

Lecția 4 • Prepararea probelor proteice

Detaliază metodele de liză, testele de cuantificare a proteinelor și prepararea tamponului de probă. Prepararea consistentă a probei este o condiție prealabilă pentru rezultate reproductibile SDS-PAGE.

Lecția 1 • Sisteme de detecție și generare de semnal

Compară metodele de detecție prin chemiluminiscență ECL, fluorescentă și colorimetrică. Studenții selectează sisteme de detecție în funcție de cerințele de sensibilitate și instrumentația disponibilă.

Lecția 2 • Blocarea și incubarea cu anticorpi

Acoperă agenți de blocare, optimizarea diluției anticorpului primar și selectarea anticorpului secundar. Condițiile corecte de blocare și de anticorpi minimizează fondul și maximizează specificitatea semnalului.

Lecția 3 • Transferul proteinelor pe membrane

Compară sistemele de transfer umed, semi-uscat și uscat și membranele PVDF vs. nitroceluloză. Eficiența transferului determină direct sensibilitatea detecției în etapele ulterioare.

Lecția 4 • Analiza cantitativă Western Blot

Introduce controale de încărcare, strategii de normalizare și software de densitometrie. Studenții produc date cantitative valide statistic din imagini western blot.

Lecția 1 • Rehidratarea benzilor IPG și protocolul IEF

Detaliază metodele de încărcare a probei, condițiile de rehidratare și programele de creștere a tensiunii IEF. Executarea corectă a protocolului previne dungile orizontale și asigură o focalizare clară.

Lecția 2 • Principiile PAGE nativ

Explică separarea prin sarcină, dimensiune și formă în condiții nedenaturante. Studenții înțeleg când PAGE nativ este preferat SDS-PAGE pentru studii funcționale.

Lecția 3 • Fundamentele focalizării izoelectrice

Explică formarea gradientului de pH, focalizarea proteinelor la pI și sistemele cu amfoliți purtători vs. benzi IPG. IEF rezolvă proteine care diferă cu doar 0,01 unități de pH.

Lecția 4 • Electroforeză bidimensională pe gel

Combină IEF și SDS-PAGE pentru a rezolva mii de proteine în funcție de pI și greutatea moleculară. Studenții execută fluxuri de lucru 2-DE și interpretează modele complexe de pete.

Lecția 1 • Electroforeză capilară pe gel pentru acizi nucleici

Aplică capilare umplute cu polimer pentru dimensionarea fragmentelor de ADN și evaluarea calității ARN-ului. CGE înlocuiește gelurile în placă cu analiză automatizată, cantitativă și de randament ridicat.

Lecția 2 • Electroforeză capilară de zonă

Acoperă principiile de separare CZE, selectarea tamponului și modurile de injecție pentru molecule mici și proteine. Studenții dezvoltă și validează metode CZE pentru clase definite de analiți.

Lecția 3 • Instrumentația pentru electroforeză capilară

Descrie dimensiunile capilarelor, sursele de înaltă tensiune, detectoarele și componentele autosamplerului. Familiarizarea cu instrumentul este o condiție prealabilă pentru dezvoltarea metodei în secțiunile ulterioare.

Lecția 4 • Focalizare izoelectrică capilară

Adaptează principiile IEF la formatul capilar pentru determinarea pI-ului proteinelor și profilarea izoformelor. Studenții compară cIEF cu IEF pe gel în ceea ce privește rezoluția și randamentul.

Lecția 1 • Dezvoltarea și validarea metodei

Aplică principiile planificării experimentelor pentru a optimiza procentul de gel, tamponul și condițiile de desfășurare. Parametrii de validare includ specificitatea, liniaritatea, intervalul și reproductibilitatea.

Lecția 2 • Densitometrie cantitativă și analiză de imagine

Acoperă setările de achiziție a imaginii, scăderea fondului și analiza profilului benzilor pentru o cuantificare precisă. Studenții utilizează instrumente software pentru a extrage date numerice fiabile din imaginile gelurilor.

Lecția 3 • Electroforeză pe gel cu câmp pulsat

Explică principiile câmpului electric alternativ care permit separarea ADN-ului de megabaze. Studenții aplică PFGE pentru tipizarea microbiană și analiza genomurilor mari.

Lecția 4 • Integrarea cu metode analitice ulterioare

Conectează rezultatele electroforezei la spectrometria de masă, secvențierea și testele funcționale. Studenții proiectează fluxuri de lucru în mai multe etape în care electroforeza servește ca etapă preparativă sau analitică.