Curso Básico de Eletroforese

Aula 1 • Desenvolvimento Histórico da Eletroforese

Traça os marcos principais desde o trabalho de fronteira móvel de Tiselius até aos sistemas de gel modernos. Fornece contexto para compreender a diversidade atual de técnicas.

Aula 2 • Eletricidade e Movimento Iónico

Aborda carga, tensão, corrente e resistência tal como se aplicam a iões em solução. Relaciona a lei de Ohm com a configuração prática de eletroforese.

Aula 3 • Tampões e Controlo de pH

Ensina a seleção de tampões, a força iónica e a estabilidade do pH durante uma corrida. Uma tamponização adequada é essencial para separações reprodutíveis.

Aula 4 • Forças Motrizes da Separação

Define a mobilidade eletroforética e as forças que se opõem à migração. Estabelece a base teórica para a resolução de bandas.

Aula 1 • Critérios de Seleção de Matriz

Orienta decisões entre agarose e poliacrilamida com base no tipo e tamanho da molécula. Reforça a ligação entre a escolha da matriz e os objetivos experimentais.

Aula 2 • Técnicas de Preparação de Gel

Fornece protocolos passo a passo para vazar ambos os tipos de gel de forma segura e reprodutível. Enfatiza a desgaseificação, o nivelamento e a colocação dos pentes.

Aula 3 • Avaliação da Qualidade do Gel

Ensina verificações visuais e funcionais da integridade do gel antes de carregar as amostras. A má qualidade do gel é uma das principais causas de falhas nas separações.

Aula 4 • Fundamentos do Gel de Agarose

Descreve a estrutura do polímero de agarose, o tamanho dos poros e os efeitos da concentração. Relaciona a percentagem do gel com a gama de tamanhos de moléculas resolvidas.

Aula 1 • Condições de Corrida e Parâmetros

Define tensão, tempo de corrida e seleção de tampão para géis de ácidos nucleicos. A otimização destes parâmetros equilibra a velocidade com a resolução.

Aula 2 • Resolução de Problemas em Géis de Ácidos Nucleicos

Identifica causas de arrastamento, bandas ausentes e distorção de pistas. O diagnóstico sistemático evita falhas experimentais repetidas.

Aula 3 • Preparação de Amostras para Ácidos Nucleicos

Aborda a quantificação de ADN e ARN, a avaliação de pureza e a composição do tampão de carregamento. Uma preparação adequada da amostra evita arrastamento e distorção de pistas.

Aula 4 • Métodos de Coloração e Visualização

Compara o brometo de etídio, o SYBR Safe e outros corantes intercalantes para deteção de ácidos nucleicos. Aborda sensibilidade, segurança e requisitos de imagem.

Aula 1 • Estimativa de Peso Molecular

Ensina a construção de curvas padrão a partir de marcadores de proteínas para estimar pesos moleculares desconhecidos. A estimativa precisa requer uma seleção adequada do marcador.

Aula 2 • Conceção e Vazamento do Sistema de Gel

Aborda a composição dos géis de empilhamento e de resolução, as diferenças de pH e os sistemas de tampão descontínuos. A conceção adequada afia a entrada e a resolução das bandas.

Aula 3 • Preparação de Amostras de Proteínas

Detalha métodos de lise, quantificação de proteínas e preparação do tampão de amostra para SDS-PAGE. A preparação consistente da amostra é crítica para padrões de bandas reprodutíveis.

Aula 4 • Corrida e Coloração de Géis SDS-PAGE

Fornece protocolos para condições de eletroforese, coloração com Coomassie e coloração com prata. A escolha da coloração depende da sensibilidade e da utilização a jusante.

Aula 1 • Coloração de Atividade Após PAGE Nativa

Aborda ensaios de atividade enzimática no gel para identificar proteínas funcionais após separação nativa. Relaciona a posição da banda com a função enzimática.

Aula 2 • Técnica de PAGE Nativa Azul

Apresenta o Coomassie G-250 como agente de deslocamento de carga na PAGE nativa azul para proteínas de membrana. Esta técnica resolve complexos proteicos mantendo interações nativas.

Aula 3 • Seleção de Tampão e pH para Géis Nativos

Orienta a escolha de pH e tampão para manter a carga e a estabilidade das proteínas durante corridas nativas. As condições do tampão afetam diretamente a direção da migração e a nitidez das bandas.

Aula 4 • Princípios da Eletroforese Nativa

Contrasta a PAGE nativa com a SDS-PAGE, enfatizando que a separação depende da carga, do tamanho e da forma. Estabelece quando as condições nativas são necessárias.

Aula 1 • Re-hidratação e Carregamento de Tiras IPG

Detalha protocolos de re-hidratação, métodos de carregamento de amostras e carregamento por copo versus re-hidratação no gel. O carregamento correto maximiza a entrada e a resolução das proteínas.

Aula 2 • Princípios de Focalização Isoelétrica

Explica como as proteínas migram para o seu ponto isoelétrico num gradiente de pH. A IEF fornece a primeira dimensão da eletroforese bidimensional.

Aula 3 • Condições de Corrida de IEF

Aborda protocolos de rampa de tensão, volt-hora total e controlo de temperatura para IEF. Condições de corrida adequadas previnem a precipitação de proteínas no pI.

Aula 4 • Coloração de Géis 2D e Análise de Imagem

Aborda a coloração fluorescente e coloidal para géis 2D e a deteção de manchas por software. A análise quantitativa requer coloração consistente e aquisição de imagem calibrada.

Aula 1 • Tipos de Capilares e Revestimentos

Compara capilares de sílica fundida nua, revestidos e preenchidos com gel para diferentes analitos. A seleção do capilar determina o controlo do EOF e a interação com o analito.

Aula 2 • Sistemas de Deteção em EC

Aborda a deteção por absorção UV, por fluorescência induzida por laser e por espetrometria de massa para EC. A escolha do detetor governa a sensibilidade e a capacidade de identificação do analito.

Aula 3 • Desenvolvimento e Otimização de Métodos de EC

Orienta a seleção de tampão, tensão e temperatura para otimização de separações por EC. O desenvolvimento sistemático de métodos reduz o tempo de corrida mantendo a resolução.

Aula 4 • Fundamentos de Eletroforese Capilar

Apresenta a instrumentação de EC, o fluxo eletroosmótico e os modos de separação. A EC oferece maior resolução e automação em comparação com os formatos de gel em placa.

Aula 1 • Documentação e Integridade dos Dados

Estabelece padrões para captura de imagem, formatos de ficheiro e registos em caderno de laboratório. A documentação adequada apoia a reprodutibilidade e a conformidade regulamentar.

Aula 2 • Análise Estatística de Dados de Gel

Aplica estatística descritiva, análise de réplicas e testes de significância a resultados de eletroforese. O rigor estatístico distingue diferenças reais do ruído experimental.

Aula 3 • Análise Quantitativa de Bandas e Manchas

Ensina densitometria, normalização de pistas e subtração de fundo para imagens de gel. A quantificação precisa requer aquisição de imagem calibrada e protocolos consistentes.

Aula 4 • Artefactos Comuns e Suas Causas

Cataloga artefactos de gel, incluindo fantasma, bandas satélite e migração irregular. O reconhecimento de artefactos previne a má interpretação dos resultados.