Curso de Citometria de Fluxo

Aula 1 • Geração e Deteção de Sinal

Aborda como os fotões são convertidos em sinais eletrónicos pelos detetores e amplificados para análise. Relaciona o tipo de detetor e as definições de ganho com a sensibilidade analítica e a gama dinâmica.

Aula 2 • Princípios da Luz e da Ótica

Explica como a luz interage com as partículas para produzir sinais de dispersão e fluorescência. Fornece a base ótica necessária para compreender a colocação dos detetores e a seleção de filtros.

Aula 3 • Visão Geral dos Parâmetros de Dados

Apresenta a dispersão frontal, a dispersão lateral e os canais de fluorescência como os principais parâmetros medidos. Prepara os formandos para interpretar gráficos de pontos e histogramas em capítulos posteriores.

Aula 4 • História e Aplicações Principais

Traça a evolução da citometria de fluxo, desde os primeiros contadores celulares até às plataformas multiparâmetro modernas. Estabelece os contextos clínico, de investigação e industrial que motivam toda a aprendizagem técnica subsequente.

Aula 1 • Mecânica do Separador Celular

Apresenta os mecanismos de separação eletrostática e microfluídica que separam fisicamente as populações alvo. Diferencia as configurações dos separadores com base nos compromissos entre pureza, rendimento e débito.

Aula 2 • Práticas de Controlo de Qualidade do Instrumento

Estabelece rotinas diárias e periódicas de CQ utilizando microesferas de calibração e protocolos padronizados. Garante que os formandos podem verificar o desempenho do instrumento antes de cada experiência.

Aula 3 • Fontes de Laser e Modelação do Feixe

Examina os tipos de laser, os níveis de potência e a ótica de modelação do feixe utilizados nos citómetros modernos. Relaciona a escolha do laser com a eficiência de excitação dos fluorocromos e o desenho do painel de análises.

Aula 4 • Matrizes de Detetores e Eletrónica

Mapeia o percurso desde a recolha de fotões através das matrizes de detetores até à saída de dados digitalizados. Fundamenta os formandos nas definições de voltagem, ganho e limiar que controlam a aquisição de dados.

Aula 1 • Fotofísica dos Fluorocromos

Explica os espetros de absorção, o rendimento quântico e o coeficiente de extinção como determinantes do brilho do fluorocromo. Fornece a base quantitativa para comparar reagentes entre painéis de análises.

Aula 2 • Fluxo de Trabalho de Desenho de Painéis de Análises

Fornece um processo sistemático para associar fluorocromos a alvos, instrumentos e objetivos experimentais. Os formandos aplicam a hierarquia de brilho e as regras de densidade antigénica para construir painéis de análises otimizados.

Aula 3 • Qualidade do Conjugado de Anticorpos

Aborda a razão fluorocromo-proteína, a variabilidade lote a lote e as condições de armazenamento que afetam o desempenho do conjugado. Ensina os formandos a avaliar e validar os reagentes de anticorpos antes da utilização.

Aula 4 • Sobreposição Espetral e Derramamento

Quantifica como a emissão de um fluorocromo contamina os canais de detetores adjacentes e por que razão é necessária a compensação. Prepara os formandos para os procedimentos de compensação abordados no capítulo seguinte.

Aula 1 • Avaliação da Viabilidade Celular

Ensina estratégias de exclusão e de corante de viabilidade fixável para excluir células mortas que causam falsos positivos. Relaciona a delimitação da viabilidade com a exatidão analítica dos dados a jusante.

Aula 2 • Tipos de Amostras Biológicas e Manuseamento

Compara os requisitos de preparação para amostras de sangue total, medula óssea, tecido sólido e cultura de células. Estabelece regras de manuseamento que previnem artefactos antes do início da coloração.

Aula 3 • Fixação, Armazenamento e Biossegurança

Aborda a fixação pós-coloração para preservação de amostras e inativação de agentes patogénicos em contextos de biossegurança. Garante que os formandos cumprem as normas de manuseamento seguro para amostras infeciosas.

Aula 4 • Coloração Intracelular e Nuclear

Aborda as químicas de fixação e permeabilização necessárias para aceder a alvos citoplasmáticos e nucleares. Aborda a compatibilidade entre os reagentes de fixação e a estabilidade dos fluorocromos.

Aula 1 • Cálculo da Matriz de Compensação

Explica a derivação matemática dos coeficientes de derramamento e como o software os aplica aos dados brutos. Permite que os formandos detetem e corrijam erros de compensação antes da análise.

Aula 2 • Controlos de Compensação

Especifica os tipos de controlos monocromáticos necessários e as regras para a sua preparação e utilização. Estabelece por que razão os controlos devem corresponder às condições de coloração da amostra para serem válidos.

Aula 3 • Estratégias de Otimização da Voltagem

Ensina a titulação sistemática da voltagem utilizando microesferas e células para posicionar as populações de forma ótima em cada detetor. Relaciona as definições de voltagem com a resolução de populações pouco brilhantes em relação ao ruído de fundo.

Aula 4 • Definições de Aquisição e Parâmetros de Série Analítica

Aborda os alvos de contagem de eventos, a velocidade de aquisição e as regiões de paragem que garantem uma recolha de dados estatisticamente robusta. Prepara os formandos para configurar modelos de aquisição para experiências reprodutíveis.

Aula 1 • Técnicas de Delimitação de Fluorescência

Aborda estratégias de delimitação booleana, sequencial e inversa para resolver painéis de análises complexos de imunofenotipagem. Relaciona a colocação de regiões com os controlos FMO e o conhecimento biológico.

Aula 2 • Formatos de Ficheiros de Dados e Software

Apresenta o formato de ficheiro FCS e o panorama das opções de software de análise disponíveis para os investigadores. Estabelece práticas de gestão de ficheiros que suportam fluxos de trabalho de análise reprodutíveis.

Aula 3 • Delimitação Baseada na Dispersão

Ensina a delimitação FSC/SSC para isolar células singletas viáveis de detritos, agregados e células mortas. Estabelece a primeira região em cada árvore de análise hierárquica.

Aula 4 • Resultados Estatísticos e Reporte

Explica as métricas de percentagem de positivos, intensidade de fluorescência mediana e contagem celular, e a sua utilização adequada. Ensina os formandos a selecionar e reportar estatísticas que correspondam à sua questão experimental.

Aula 1 • Ensaios Multiplex Baseados em Microesferas

Apresenta as matrizes de microesferas para a quantificação simultânea de múltiplos analitos solúveis num citómetro de fluxo. Aborda a configuração do ensaio, a geração da curva padrão e a interpretação dos dados.

Aula 2 • Ensaios de Apoptose e Morte Celular

Integra ensaios de Anexina V, caspase e potencial de membrana mitocondrial para distinguir os estádios da apoptose. Permite que os formandos concebam painéis de análises multiparâmetro da via de morte celular.

Aula 3 • Ensaios Funcionais por Citometria de Fluxo

Aborda protocolos de coloração intracelular de citocinas, desgranulação e fosfofluxo para medir a função celular. Relaciona as condições de estimulação e a temporização da fixação com a sensibilidade analítica do ensaio.

Aula 4 • Imunofenotipagem de Alta Dimensão

Alarga o desenho do painel de análises para mais de 20 parâmetros para uma caracterização imunitária profunda de amostras de sangue e tecido. Aborda os desafios únicos da compatibilidade de reagentes e da complexidade dos dados em alta dimensionalidade.

Aula 1 • Reporte e Apresentação de Dados

Estabelece normas para apresentar dados de citometria de fluxo em publicações, relatórios e submissões regulamentares. Aborda a construção de figuras, a exibição da hierarquia de delimitação e os requisitos de transparência dos dados.

Aula 2 • Interpretação da Variabilidade Biológica

Distingue o ruído técnico da verdadeira variação biológica em conjuntos de dados citométricos. Ensina os formandos a contextualizar os resultados dentro da biologia conhecida e dos valores de referência publicados.

Aula 3 • Delimitação Automatizada e Computacional

Apresenta algoritmos de agrupamento e ferramentas de delimitação automatizada que reduzem o viés do operador em dados de alta dimensão. Avalia quando as abordagens automatizadas superam a delimitação manual.

Aula 4 • Análise Estatística para Dados de Fluxo

Aplica testes paramétricos e não paramétricos adequados às distribuições e tamanhos amostrais dos dados citométricos. Aborda as correções para comparações múltiplas e o reporte do tamanho do efeito.