Corso Base di Elettroforesi

Lezione 1 • Sviluppo Storico dell'Elettroforesi

Traccia le tappe fondamentali, dal lavoro di Tiselius sul fronte mobile fino ai moderni sistemi su gel. Fornisce il contesto per comprendere la diversità delle tecniche attuali.

Lezione 2 • Elettricità e Movimento Ionico

Tratta carica, voltaggio, corrente e resistenza applicati agli ioni in soluzione. Collega la legge di Ohm all'allestimento pratico dell'elettroforesi.

Lezione 3 • Tamponi e Controllo del pH

Insegna la scelta del tampone, la forza ionica e la stabilità del pH durante una corsa. Un tamponamento adeguato è essenziale per separazioni riproducibili.

Lezione 4 • Forze Trainanti della Separazione

Definisce la mobilità elettroforetica e le forze che si oppongono alla migrazione. Stabilisce le basi teoriche per la risoluzione delle bande.

Lezione 1 • Criteri di Scelta della Matrice

Guida le decisioni tra agarosio e poliacrilammide in base al tipo e alle dimensioni della molecola. Rafforza il legame tra la scelta della matrice e gli obiettivi sperimentali.

Lezione 2 • Tecniche di Preparazione del Gel

Fornisce protocolli passo-passo per colare entrambi i tipi di gel in modo sicuro e riproducibile. Sottolinea il degasaggio, il livellamento e il posizionamento del pettine.

Lezione 3 • Valutazione della Qualità del Gel

Insegna i controlli visivi e funzionali per l'integrità del gel prima di caricare i campioni. Una scarsa qualità del gel è una delle principali cause di separazioni fallite.

Lezione 4 • Fondamenti del Gel di Agarosio

Descrive la struttura del polimero di agarosio, la dimensione dei pori e gli effetti della concentrazione. Collega la percentuale di gel all'intervallo di dimensioni delle molecole risolte.

Lezione 1 • Condizioni e Parametri di Corsa

Definisce voltaggio, tempo di corsa e scelta del tampone per gel di acidi nucleici. L'ottimizzazione di questi parametri bilancia la velocità con la risoluzione.

Lezione 2 • Risoluzione dei Problemi dei Gel di Acidi Nucleici

Identifica le cause di strisciamento, bande mancanti e distorsione delle corsie. Una diagnosi sistematica previene ripetuti fallimenti sperimentali.

Lezione 3 • Preparazione del Campione per Acidi Nucleici

Tratta la quantificazione di DNA e RNA, la valutazione della purezza e la composizione del tampone di caricamento. Una corretta preparazione del campione previene strisciamenti e distorsioni delle corsie.

Lezione 4 • Metodi di Colorazione e Visualizzazione

Confronta il bromuro di etidio, SYBR Safe e altri coloranti intercalanti per la rilevazione degli acidi nucleici. Affronta sensibilità, sicurezza e requisiti di imaging.

Lezione 1 • Stima del Peso Molecolare

Insegna la costruzione di curve standard a partire da marcatori proteici per stimare pesi molecolari incogniti. Una stima accurata richiede la corretta scelta del marcatore.

Lezione 2 • Progettazione e Colaggio del Sistema di Gel

Tratta la composizione del gel di stacking e di risoluzione, le differenze di pH e i sistemi tampone discontinui. Una progettazione adeguata migliora l'ingresso delle bande e la risoluzione.

Lezione 3 • Preparazione del Campione Proteico

Descrive in dettaglio i metodi di lisi, la quantificazione delle proteine e la preparazione del tampone di caricamento per SDS-PAGE. Una preparazione del campione coerente è fondamentale per pattern di bande riproducibili.

Lezione 4 • Corsa e Colorazione dei Gel SDS-PAGE

Fornisce protocolli per le condizioni di elettroforesi, la colorazione con Coomassie e la colorazione con argento. La scelta del colorante dipende dalla sensibilità e dall'uso a valle.

Lezione 1 • Colorazione di Attività Dopo PAGE Nativa

Tratta i saggi di attività enzimatica in gel per identificare proteine funzionali dopo separazione nativa. Collega la posizione della banda alla funzione enzimatica.

Lezione 2 • Tecnica Blue Native PAGE

Introduce il Coomassie G-250 come agente di spostamento di carica nella blue native PAGE per proteine di membrana. Questa tecnica risolve i complessi proteici mantenendo le interazioni native.

Lezione 3 • Scelta del Tampone e del pH per Gel Nativo

Guida la scelta del pH e del tampone per mantenere la carica e la stabilità delle proteine durante le corse native. Le condizioni del tampone influenzano direttamente la direzione di migrazione e la nitidezza delle bande.

Lezione 4 • Principi dell'Elettroforesi Nativa

Confronta la PAGE nativa con la SDS-PAGE, sottolineando che la separazione dipende da carica, dimensione e forma. Stabilisce quando sono richieste le condizioni native.

Lezione 1 • Reidratazione e Caricamento delle IPG Strip

Descrive in dettaglio i protocolli di reidratazione, i metodi di caricamento del campione e il caricamento a coppetta rispetto alla reidratazione in gel. Un caricamento corretto massimizza l'ingresso delle proteine e la risoluzione.

Lezione 2 • Principi dell'Isoelettrofocalizzazione

Spiega come le proteine migrano verso il loro punto isoelettrico in un gradiente di pH. L'IEF fornisce la prima dimensione dell'elettroforesi 2D.

Lezione 3 • Condizioni di Corsa dell'IEF

Tratta i protocolli di incremento graduale del voltaggio, i voltora totali e il controllo della temperatura per l'IEF. Condizioni di corsa adeguate prevengono la precipitazione delle proteine al pI.

Lezione 4 • Colorazione e Analisi d'Immagine di Gel 2D

Tratta la colorazione fluorescente e colloidale per gel 2D e la rilevazione software degli spot. L'analisi quantitativa richiede una colorazione coerente e un imaging calibrato.

Lezione 1 • Tipi di Capillare e Rivestimenti

Confronta capillari in silice fusa nuda, rivestiti e riempiti di gel per diversi analiti. La scelta del capillare determina il controllo del flusso elettroosmotico e l'interazione con l'analita.

Lezione 2 • Sistemi di Rilevazione in CE

Tratta l'assorbanza UV, la fluorescenza indotta da laser e la spettrometria di massa per la CE. La scelta del rivelatore determina la sensibilità e la capacità di identificazione dell'analita.

Lezione 3 • Sviluppo e Ottimizzazione del Metodo CE

Guida la scelta del tampone, il voltaggio e l'ottimizzazione della temperatura per le separazioni CE. Lo sviluppo sistematico del metodo riduce il tempo di corsa mantenendo la risoluzione.

Lezione 4 • Fondamenti dell'Elettroforesi Capillare

Introduce la strumentazione CE, il flusso elettroosmotico e le modalità di separazione. La CE offre una risoluzione e un'automazione superiori rispetto ai formati di gel su lastra.

Lezione 1 • Documentazione e Integrità dei Dati

Stabilisce standard per l'acquisizione delle immagini, i formati di file e i registri del quaderno di laboratorio. Una documentazione adeguata supporta la riproducibilità e la conformità normativa.

Lezione 2 • Analisi Statistica dei Dati su Gel

Applica la statistica descrittiva, l'analisi delle repliche e i test di significatività ai risultati di elettroforesi. Il rigore statistico distingue le differenze reali dal rumore sperimentale.

Lezione 3 • Analisi Quantitativa di Bande e Spot

Insegna la densitometria, la normalizzazione delle corsie e la sottrazione del fondo per le immagini su gel. Una quantificazione accurata richiede un imaging calibrato e protocolli coerenti.

Lezione 4 • Artefatti Comuni e Loro Cause

Cataloga gli artefatti del gel, inclusi ghosting, bande satellite e migrazione irregolare. Riconoscere gli artefatti previene un'errata interpretazione dei risultati.