Corso di Tecniche Immunologiche

Lezione 1 • Antigeni, Anticorpi ed Epitopi

Definisce la struttura dell'antigene, la mappatura degli epitopi e l'architettura degli anticorpi. Comprendere queste relazioni è essenziale per progettare e interpretare i saggi di legame.

Lezione 2 • Sicurezza in Laboratorio e Livelli di Biosicurezza

Tratta le classificazioni di biosicurezza, i dispositivi di protezione individuale e lo smaltimento dei rifiuti per il lavoro immunologico. La conformità agli standard di biosicurezza è obbligatoria prima di iniziare il lavoro al banco.

Lezione 3 • Citochine e Segnalazione Immunitaria

Introduce le famiglie di citochine, i recettori e le cascate di segnalazione. Questa conoscenza supporta l'interpretazione dei saggi funzionali e dei pannelli multiplex per citochine.

Lezione 4 • Panoramica sull'Immunità Innata e Adattativa

Tratta i componenti cellulari e molecolari di entrambi i rami dell'immunità. Fornisce il contesto biologico che è alla base di ogni saggio eseguito nei capitoli successivi.

Lezione 1 • Accuratezza e Precisione nel Pipettaggio

Insegna la corretta selezione della pipetta, i controlli di calibrazione e la tecnica per volumi che vanno dai nanolitri ai millilitri. Gli errori in questa fase si propagano in ogni saggio a valle.

Lezione 2 • Preparazione dei Tamponi e Controllo del pH

Tratta la formulazione dei tamponi immunologici comuni e la regolazione del pH. La corretta composizione del tampone influenza direttamente il legame anticorpale e la vitalità cellulare.

Lezione 3 • Metodi di Quantificazione delle Proteine

Confronta i saggi BCA, Bradford e basati sull'assorbanza per la misurazione delle proteine totali. Una quantificazione proteica accurata normalizza i campioni prima dei saggi immunologici.

Lezione 4 • Raccolta di Campioni di Sangue e Tessuto

Descrive le provette per venipuntura, la gestione delle biopsie tissutali e le variabili pre-analitiche. Una raccolta corretta previene l'emolisi e la degradazione proteica che compromettono i risultati.

Lezione 1 • Anticorpi di Rilevazione e Coniugati Enzimatici

Tratta la selezione degli anticorpi secondari, la chimica dei coniugati HRP e AP e i sistemi di substrato. La qualità del coniugato controlla direttamente il rapporto segnale/rumore.

Lezione 2 • Risoluzione dei Problemi e Validazione dell'ELISA

Diagnostica sistematicamente il background elevato, il segnale basso e gli artefatti da effetto hook. I parametri di validazione assicurano che le prestazioni del saggio soddisfino gli standard normativi e di pubblicazione.

Lezione 3 • Strategie di Rivestimento della Piastra e di Bloccaggio

Tratta le condizioni di adsorbimento dell'antigene e dell'anticorpo di cattura e la selezione dell'agente bloccante. Un bloccaggio inadeguato è la causa principale del background elevato nell'ELISA.

Lezione 4 • Principi dell'ELISA e Scelta del Formato

Spiega la cinetica del legame antigene-anticorpo e la logica alla base di ciascun formato ELISA. La scelta del formato determina la sensibilità, la specificità e la produttività per un dato analita.

Lezione 1 • Incubazione e Rilevazione degli Anticorpi

Tratta la diluizione dell'anticorpo primario e secondario, le condizioni di incubazione e la rilevazione ECL rispetto a quella fluorescente. L'ottimizzazione degli anticorpi previene le bande aspecifiche.

Lezione 2 • Acquisizione delle Immagini e Densitometria

Insegna l'esposizione su pellicola, l'imaging digitale e la quantificazione densitometrica dell'intensità delle bande. Una densitometria accurata richiede la normalizzazione rispetto ai controlli di carico.

Lezione 3 • Risoluzione dei Problemi degli Artefatti nel Western Blot

Identifica le cause di background elevato, bande mancanti e trasferimento non uniforme. La risoluzione sistematica dei problemi riduce lo spreco di reagenti e i tassi di fallimento sperimentale.

Lezione 4 • Elettroforesi su Gel SDS-PAGE

Tratta la preparazione del gel, la denaturazione del campione e la separazione elettroforetica in base al peso molecolare. La selezione corretta della percentuale del gel risolve le proteine nell'intervallo di dimensione bersaglio.

Lezione 1 • Scelta dei Fluorocromi e Progettazione del Pannello

Tratta la sovrapposizione spettrale, la compensazione dello spillover e la gerarchia di luminosità dei fluorocromi. Pannelli progettati male producono popolazioni irrisolvibili e fenotipizzazioni inaccurate.

Lezione 2 • Analisi dei Dati e Report

Tratta l'analisi basata su software, le statistiche di popolazione e la presentazione grafica dei dati di flusso. Un report corretto include le impostazioni di compensazione e la logica di gating per la riproducibilità.

Lezione 3 • Protocolli di Colorazione dei Campioni

Dettaglia i flussi di lavoro per la colorazione di superficie, intracellulare e intranucleare. Ogni tipo di colorazione richiede condizioni specifiche di fissazione e permeabilizzazione.

Lezione 4 • Strumentazione per Citometria a Flusso

Spiega le sorgenti laser, i filtri ottici, i rivelatori e i sistemi fluidici. Comprendere l'hardware previene l'interpretazione errata degli artefatti specifici dello strumento.

Lezione 1 • Controcolorazione Nucleare e degli Organelli

Tratta l'uso di DAPI, ioduro di propidio e coloranti specifici per organelli per una colorazione contestuale. Le controcolorazioni forniscono un riferimento morfologico per la localizzazione dei marcatori immunitari.

Lezione 2 • Analisi e Quantificazione delle Immagini

Insegna la misurazione dell'intensità di fluorescenza, i coefficienti di co-localizzazione e il conteggio cellulare utilizzando software di analisi delle immagini. L'imaging quantitativo converte i dati visivi in risultati statisticamente validi.

Lezione 3 • Immunofluorescenza Diretta e Indiretta

Spiega le strategie di colorazione con anticorpi primari e secondari e la scelta del fluoroforo per le sezioni tissutali. La colorazione indiretta amplifica il segnale ma richiede controlli di specificità aggiuntivi.

Lezione 4 • Microscopia Confocale e a Largo Campo

Confronta la microscopia a epifluorescenza a largo campo e la microscopia confocale a scansione laser per risoluzione e profondità. Il sezionamento ottico confocale risolve la co-localizzazione in tre dimensioni.

Lezione 1 • Saggi di Fagocitosi e Burst Ossidativo

Misura la capacità fagocitica di macrofagi e neutrofili e la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Questi saggi valutano la funzione effettrice dell'immunità innata in vitro.

Lezione 2 • Saggi di Citotossicità e Morte Cellulare

Spiega i saggi di rilascio di LDH, calceina-AM e annessina V per misurare l'attività killer di NK e CTL. Distinguere l'apoptosi dalla necrosi richiede strategie di colorazione complementari.

Lezione 3 • Saggi di Secrezione delle Citochine ed ELISpot

Tratta la tecnica ELISpot per la secrezione di citochine da singola cellula e i pannelli multiplex di citochine basati su biglie. L'ELISpot rileva rare cellule antigene-specifiche a frequenze non rilevabili con l'ELISA.

Lezione 4 • Saggi di Proliferazione Linfocitaria

Tratta la diluizione di CFSE, l'incorporazione di BrdU e la colorazione con Ki-67 per quantificare la proliferazione antigene-guidata. I saggi di proliferazione valutano la reattività delle cellule T e B agli stimoli.

Lezione 1 • Applicazioni Traslazionali e Cliniche

Collega le tecniche di laboratorio all'immunologia diagnostica, allo sviluppo di vaccini e al monitoraggio dell'immunoterapia. Gli studenti valutano come i saggi di banco informino il processo decisionale clinico.

Lezione 2 • Immunoprecipitazione e Co-IP

Tratta la cattura dell'antigene con coniugati anticorpo-biglia e la co-immunoprecipitazione delle proteine interagenti. Queste tecniche mappano le interazioni proteina-proteina nei complessi di segnalazione immunitaria.

Lezione 3 • Analisi Statistica per Dati Immunologici

Tratta i test parametrici e non parametrici, il calcolo della dimensione del campione e le correzioni per confronti multipli. Una statistica appropriata previene conclusioni falsamente positive negli studi immunologici.

Lezione 4 • Controlli Sperimentali e Riproducibilità

Definisce i controlli positivi, negativi, isotipici e biologici per ciascun tipo di saggio. Controlli rigorosi sono il fondamento di dati immunologici riproducibili e pubblicabili.